Ke skupině Dr. Evžena Bouři na ÚOCHB jsem se přidala v 15 letech. Od té doby se věnuji virovým enzymům.
Na této stránce se snažím krátce popsat svou práci.
Rovněž budu ráda, když si přečtete můj první vědecký článek, v němž sdílím první autorství s Andreou Huškovou.
Proč mne zajímají virové enzymy
Inhibitory jsou malé molekuly, které se váží na proteiny a inhibují jejich funkci. Pokud jde o virové enzymy, inhibitory představují ideální způsob, jakým vyvíjet antivirotika ničící virové infekce.
Jak získat antivirotika?
Antivirotika lze získat pomocí testování existujících molekul nebo designu molekul zcela nových.
Ve skupině Dr. Bouři máme za cíl obojí – screening i design léčiv. Za tímto účelem studujeme funkce a struktury virových proteinů metodami biofyziky a biochemie.
Screening
Screening vyžaduje tyto kroky:
- zisk aktivního enzymu,
- optimalizace reakčních podmínek,
- použití analýzy (v ang. assay), která je vhodná pro tzv. vysokovýkonný screeningový test (v ang. high throughput screening).
V momentě, kdy máme aktivní enzym a robustní, rychlou a ekonomickou analýzu, lze otestovat tisíce existujících molekul. Nalezneme-li inhibitor, máme naději na nové antivirotikum.
Design
Design zcela nových léků vyžaduje, abychom virový enzym podrobili biofyzikálním metodám, jako je např. rentgenové krystalografie nebo kryogenní elektronová mikroskopie. Tyto metody mohou umožnit vyřešení 3D struktur enzymů.
V případě, že uspějeme, mediciální chemici navrhnou a vyrobí zcela nové molekuly na základě proteinové struktury. Potenciál pro využití těchto molekul v medicíně je poté značný. Mediciální chemik, Dr. Radim Nencka, se svojí skupinou je dlouhodobým spolupracovníkem skupiny Dr. Evžena Bouři.
V současné době neexistují antivirotika proti viru klíšťové encefalitidy ani viru Epstein-Barrové. Konečným cílem mých projektů je proto jak screening, tak design nových antivirotických léčiv!
Strukturní analýza poskytuje důležité informace pro design nových léčiv. Z nedavného článku od Krafčíkové, P., Šilhána, J., Nencky, R. a Bouři, E. v Nature Communications 11, 3717 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-17495-9
Můj výzkum virových proteáz
Virus klíšťové encefalitidy (TBEV – tick-borne encephalitis virus) je RNA virus, patřící do rodiny Flaviviridae. Mezi příbuzné viry patří např. virus Zika, virus horečky dengue nebo zápodonilské horečky. Klíšťová encefalitida (TBE) je nejvýznamnější onemocnění přenášené klíšťaty; způsobuje poškození mozku, paralýzu i smrt.
V loňském roce jsem využila TBEV proteázu pro vyvinutí fluorescenčního vysokovýkonného screeningového testu, který je nejenom rychlý a robustní, ale i levný a aplikovatelný na veškeré +RNA-virové proteázy.
V současné době se snažím proteázu zmutovat a vykrystalizovat, abych umožnila design prvních léků proti TBE a odhalila přesný katalytický mechanismus. Pravděpodobnost, že je tento mechanismus totožný i v příbuzných virových proteázách, je vysoký. Pokud se mi tento projekt povede, možná odhalím nový cíl pro antivirotickou léčbu.
Jak jsem zkoumala proteázu z viru klíšťové encefalitidy
V rámci výzkumu viru klíšťové encefalitidy jsem realizovala dva projekty.
Projekt číslo jedna: Vývoj metody pro objevování antivirotik
Pro vývoj nové screening analýzy jsem
- připravila aktivní proteázu a její fluorescenční substrát,
- otestovala její proteolytickou aktivitu,
- stanovila optimální podmínky,
- stanovila optimální parametry měření,
- otestovala několik komerčních inhibitorů, abych ověřila její robustnost.
Byl to vzrušující a náročný úkol, při němž jsem se neustále učila z vlastních chyb. Budu ráda, když si přečtete vědecký článek, v němž jsme metodologii popsali přesně. Zde se ji snažím krátce přiblížit.
Design fluorescenční vysokovýkonné analýzy
Naše analýza je založena na jevu FRET (Försterův rezonanční přenos energie): jsou-li dvě specifické (fluorescenční) molekuly dostatečně blízko u sebe, může být jedna z nich („dárce“) excitována světlem určité vlnové délky a získanou energii může přenést na druhou molekulu („akceptor“), která buď funguje jako zhášeč nebo fluorofor, který vyzařuje světlo o jeho charakteristické vlnové délce.
Pro tuto metodu jsme navrhli fluorescenční substráty na Obrázku 2A. Vlastní substrát, tj. peptid obsahující místo rozpoznávané a štěpené proteázou, byl lemován dvěma fluorofory – zeleným fluorescenčním proteinem (GFP) a červeným fluorescenčním proteinem (mCherry).
Co je neuvěřitelně užitečné v použití fluorescenčních proteinů místo jiných fluorescenčních molekul jsou nízké náklady na výrobu. Každý biochemik je může snadno a levně připravit v laboratoři.
(A) Konstrukty fluorescenčních substrátů. PLpro je proteáza ze SARS-CoV-2, TBEVpro je proteáza z viru klíšťové encefalitidy. (B) Schéma analýzy. Nalevo excitovaný donor (GFP) přenáší energii na akceptor (mCherry), který emituje záření, díky malé vzdálenosti mezi molekulami fluoroforů. Dochází k jevu FRET. Naprao dochází proteolytickou reakcí v místě mezi spojením fluoroforů ke zvětšení vzdálenosti mezi fluorofory. FRET neprobíhá. (C) Znázornění koncentrační řady inhibitoru v mikrodestičce. Nalevo křivka raw dat. Napravo finální graf znázorňující inhibiční schopnost molekuly (vyjádřeno veličinou IC50). (D) Raw data koncentrační řady enzymu. (E) Ověření měření pomocí SDS-PAGE (SDS-gelová elektroforéza).
Co jsem měřila?
V této analýze měříme změnu červeného světla v reakčním čase.
Po posvícení zeleným světlem na naše substráty dochází k excitaci molekuly GFP. Energie získaná excitací se přenese na molekulu mCherry, která energii vyzáří v podobě červeného světla. Dochází k jevu FRET a červené světlo je v čase vyzařováno zhruba konstantně (ve skutečnosti musíme po měření provést korekturu dat kvůli postupnému vyhasínání fluorescence a cross-talku mezi fluorofory).
Když je k substrátu přidána proteáza, štěpí peptid spojující molekuly GFP a mCherry, čímž FRET ukončí. Energie se již nepřenáší na mCherry, a proto pozorujeme kontinuální pokles červeného světla. Pomocí dat o změně intenzity červené fluorescence v čase jsem vypočítala reakční rychlosti ve směsi.
Optimalizace reakčních podmínek
Před použitím analýzy na měření inhibice jsem optimalizovala reakční podmínky pomocí gelové elektroforézy (konktrétně SDS-PAGE).
Optimalizace znamená nalezení podmínek, které umožňují maximální enzymatickou aktivitu. Proto jsem otestovala různé hodnoty pH pufru (roztoku poskytujícího stabilní prostředí) a vytvořila koncentrační řady různých solí, iontů a redukčních činidel.
Po ukončení každé reakční série jsem směsi aplikovala na SDS polyakrylamidové gely, které separují proteiny na základě jejich molekulové hmotnosti. Gely jsem poté naskenovala na fluorescenčním skeneru a určila, které podmínky produkují maximální množství produktu.
Testování potenciálních inhibitorů
Pro testování jsem použila čtečku mikrodestiček, která umožňuje měřit 384 nebo dokonce 1536 reakčních směsí najednou.
Pro testování jsem vybrala několik komerčně dostupných inhibitorů dle typu proteázy (serinová) a dle výsledků z výzkumu příbuzných enzymů (zejména enzymů z virů Zika a dengue horečky). Podobně jako v případě optimalizace jsem vytvořila koncentrační řadu každého inhibitoru, pozorovala klesající červenou fluorescenci a na základě dat vypočítala korigované rychlosti reakce. Konečným výsledkem byla křivka ukazující relativní procento inhibice, vypočítané na základě kontrolních experimentů.
(A), (C), (D) IC50 křivky ukazují, jaké množství určitého inhibitoru je nutné pro 50% inhibici. (B) Ověření průběhu reakce pomocí SDS-PAGE (SDS-gelová elektroforéza). Vzorky byly odebrány po ukončení měření.
Projekt číslo dva: Objasňování proteolytického mechanismu TBEV proteázy
Ve své práci pokračuji a snažím se pomocí mutageneze a strukturní biologie pochopit mechanismus, jakým proteáza viru klíšťové encefalitidy vykonává svou funkci pomocí. S touto informací bych chtěla umožnit design specifických inhibitorů, které by se mohly dostat do medicínské praxe.
Můj výzkum virové polymerázy
Virus Epstein-Barrové virus (EBV) je DNA virus, patřící do rodiny Herpesviridae, které typicky způsobují opary a jiné latentní kožní infekce. Latence je způsobená integrací virové DNA do lidského genomu. Z toho samého důvodu bývají herpesviry spojovány s rakovinou.
Jak jsem zkoumala polymerázu z viru Epstein-Barrové
V roce 2019 jsem pracovala s polymerázou z viru Epstein-Barrové, která je v současné době studována dále. Mým cílem bylo otestovat aktivitu polymerázy a stanovit optimální reakční podmínky její katalýzy.
Design fluorescenční analýzy
DNA polymerázy katalyzují polymeraci deoxyribonukleotid trifosfátů (dNTP) na základě komplementárního řetězce DNA.
Pro sledování průběhu polymerace jsme využili fluorescenčně značený substrát. Skládal se z dlouhého řetězce DNA hybridizovaného s menším řetězcem, který sloužil jako primer pro polymerázu. Na 5’ konci primeru byla umístěna růžová fluorescenční značka (barvivo HEX).
Optimalizaci jsem provedla otestováním různých hodnot pH a různých koncentrací solí, kovových iontů, redukčních činidel a molekul dNTP.Po ukončení každé reakční série jsem směsi aplikovala na SDS polyakrylamidové gely a ty následně naskenovala. Optimální reakční podmínky jsem odečetla dle maximálního množství produktu.
Další výzkum
V současné době je polymeráza podrobována dalším enzymatickým testům a strukturním studiím. Tyto výsledky brzy jistě poskytnou nový základ pro účinné léky.
