Metody Biochemie

Zde shrnuji základní postup biochemika zkoumajícího proteiny.

Využití bakteriálních buněk pro produkci proteinů

Prvním krokem byla příprava aktivní proteázy. Pro tento účel jsem použila bakteriální buňky Escherichia coli NiCo21, jež dokáží přijmou cizí plazmid (kruhovou DNA) a začít produkovat protein zakódovaný v genetické informaci; tento proces se nazývá transformace. Buňky jsem poté nechala růst ve výživném médiu a následně je sklidila odstředěním v centrifuze. 

Izolace proteinů před niklovou kolonku

Plazmid s kýženým proteinem obsahoval mnoho dalších informací, včetně sekvence kódující pro šest molekul histidinu (tzv. histidinová kotva). Kotvu jsem přidala pro umožnění izolace proteinu přes kolonu s niklem, která má k sekvenci histidinů vysokou afinitu. 

Nejprve jsem však musela buňky zlyzovala a odstranit jejich nerozpustné složky. Využila jsem sonikátor, který buňky ničí pomocí vysoké frekvence zvuku, a rozpustné složky (tzv. supernatant) jsem izolovala odstředění. Supernatant jsem nakonec aplikovala na niklovou kolonu. 

Purifikace proteinů

Provádím alespoň dvě purifikační metody. Obvykle jde o gelovou permeační chromatografii separující proteiny na základě velikosti a iontoměničovou chromatografii separující proteiny na základě náboje. Obojí provádím v systému FPLC (rychlá proteinová kapalinová chromatografie).